Načelo eksperimenta
Elektroforeza hemoglobina ima za cilj otkriti i potvrditi različite normalne i abnormalne hemoglobine.
Zbog različitih naboja i izoelektričnih točaka različitih tipova hemoglobina, u određenoj pH puferskoj otopini, kada je izoelektrična točka hemoglobina niža od pH puferske otopine, hemoglobin nosi negativan naboj i tijekom elektroforeze migrira prema anodi. Obrnuto, hemoglobin s pozitivnim nabojem kreće se prema katodi.
Pod određenim naponom i nakon određenog vremena elektroforeze, hemoglobini s različitim nabojima i molekularnim težinama pokazuju različite smjerove i brzine migracije. To omogućuje odvajanje različitih zona, a naknadna kolorimetrijska ili elektroforetska analiza skeniranja može se provesti na tim zonama kako bi se kvantificirali različiti hemoglobini. Najčešće korištena metoda je elektroforeza celulozno-acetatne membrane pH 8,6.
Unutar citoplazme, etilen glikolne skupine (CHOH-CHOH) prisutne u glikogenu ili polisaharidnim tvarima (kao što su mukopolisaharidi, mukoproteini, glikoproteini, glikolipidi itd.) oksidiraju se periodnom kiselinom i pretvaraju u aldehidne skupine (CHO-CHO). Ove aldehidne skupine spajaju se s bezbojnim ljubičasto-crvenim Schiffovim reagensom, tvoreći ljubičasto-crvenu boju koja se taloži tamo gdje su polisaharidi prisutni u stanici. Ova reakcija je poznata kao periodična kiselina-Schiff (PAS) bojenje, ranije nazivano glikogenskim bojenjem.
Eksperimentalna metoda
Materijali:Celulozni acetatmembrane, aparat za elektroforezu(DYCP-38C i napajanje DYY-6C), Vrhunski alat za učitavanje uzoraka (pipeta), spektrofotometar, kolorimetrijske kivete, međuspremnici.
Pufer:
(1) pH 8,6 TEB pufer: izvažite 10,29 g Tris, 0,6 g EDTA, 3,2 g borne kiseline i dodajte destiliranu vodu u 1000 ml.
(2) Boratni pufer: Izvažite 6,87 g boraksa i 5,56 g borne kiseline i dodajte destiliranu vodu u 1000 ml.
Postupak:
Preparacija otopine hemoglobina
Uzmite 3 ml krvi koja sadrži heparin ili natrijev citrat kao antikoagulans. Centrifugirajte na 2000 okretaja u minuti 10 minuta i bacite plazmu. Isperite crvena krvna zrnca tri puta fiziološkom otopinom (750 okretaja u minuti, 5 minuta centrifugiranja svaki put). Centrifugirajte na 2200 okretaja u minuti 10 minuta i odbacite supernatant. Dodajte jednaku količinu destilirane vode, zatim dodajte 0,5 puta veći volumen ugljikovog tetraklorida. Snažno protresite 5 minuta, a zatim centrifugirajte na 2200 okretaja u minuti 10 minuta kako biste prikupili gornju otopinu Hb za kasniju upotrebu.
Natapanje membrane
Celulozno-acetatnu membranu izrežite na trake veličine 3 cm × 8 cm. Namočite ih u TEB pufer pH 8,6 do potpunog zasićenja, zatim ih uklonite i osušite filtar papirom.
Brljanje
Pipetom nanesite 10 μl otopine hemoglobina okomito na membranu celuloznog acetata (hrapava strana), oko 1,5 cm od ruba.
elektroforeza
Ulijte otopinu boratnog pufera u komoru za elektroforezu. Postavite membranu od celuloznog acetata s točkastom stranom na katodni kraj komore. Pustite na 200 V 30 minuta.
Eluiranje
Izrežite zone HbA i HbA2, stavite ih u zasebne epruvete i dodajte 15 ml odnosno 3 ml destilirane vode. Lagano protresite kako biste potpuno isprali hemoglobin, zatim promiješajte.
kolorimetrija
Apsorpciju stavite na nulu koristeći destiliranu vodu za otopinu za ispiranje i izmjerite apsorbanciju na 415 nm.
Kalkulacija
HbA2(%) = apsorpcija HbA2 epruvete / (Apsorbancija HbA epruvete × 5 + apsorpcija HbA2 epruvete) × 100%
Izračun eksperimentalnih rezultata
Referentni raspon za pH 8,6 TEB pufer elektroforeza s celuloznim acetatom: HbA > 95%, HbA2 1%-3,1%
Bilješke
Vrijeme elektroforeze ne smije biti predugo. Membrana od celuloznog acetata ne smije se osušiti tijekom elektroforeze. Zaustavite elektroforezu kada su HbA i HbA2 jasno odvojeni. Dugotrajna elektroforeza može uzrokovati difuziju trake i zamućenje.
Izbjegavajte korištenje previše uzorka. Prekomjerna količina tekućeg hemoglobina može dovesti do odvajanja trake ili nedovoljnog bojenja, što rezultira lažno povišenim razinama HbA.
Spriječite kontaminaciju membrane od celuloznog acetata proteinima.
Struja ne smije biti previsoka; inače se vrpce hemoglobina možda neće odvojiti.
Uvijek uključite uzorke normalnih osoba i potrebne poznate abnormalne hemoglobine kao kontrole.
Beijing Liuyi Biotechnology proizvodi profesionalni spremnik za elektroforezu za elektroforezu hemoglobina koji je modelDYCP-38Cspremnik za elektroforezu s membranom celuloznog acetata, a za spremnik za elektroforezu s membranom celuloznog acetata dostupna su dva modela napajanja za elektroforezuDYY-2CiDYY-6Cnapajanje.
U međuvremenu, Beijing Liuyi Biotechnology nudi membranu od celuloznog acetata za kupce, a veličina membrane od celuloznog acetata može se prilagoditi. Dobrodošli da nas pitate za uzorke i više informacija.
Brend Beijing Liuyi ima više od 50 godina povijesti u Kini i tvrtka može pružiti stabilne i visokokvalitetne proizvode diljem svijeta. Kroz godine razvoja, vrijedan je vašeg izbora!
Sada tražimo partnere, dobrodošli su i OEM spremnici za elektroforezu i distributeri.
Ako imate bilo kakav plan za kupnju naših proizvoda, slobodno nas kontaktirajte. Možete nam poslati poruku na email[e-mail zaštićen]ili[e-mail zaštićen], ili nas nazovite na +86 15810650221 ili dodajte Whatsapp +86 15810650221, ili Wechat: 15810650221
Vrijeme objave: 20. rujna 2023